Page 23 - Juklak Deteksi PMK RBS di Propinsi Bebas Berbatas Pulau di Indonesia 2023

2. Primer 5’UTR forward dengan Sequence 5’-CACYT-YAAGR-TGACA-
YTGRT-ACTGG-TAC-3’, Primer 5’UTR reverse dengan Sequence 5’-
CAGAT-YCCRA-GTGWC-ICITG-TTA-3’, dan Probe 5’UTR dengan

Sequence 5’-FAM-CCTCG GGGTA-CCTGA-AGGGC-ATCC-TAMRA-3’
3. Primer 3D forward dengan Sequence 5’- ACT-GGG-TTT-TAC-AAA-CCT-
GTG-A -3’, Primer 3D reverse dengan Sequence 5’-GCG-AGT-CCT-GCC-

ACG-GA -3’, dan Probe 3D dengan Sequence 5’-FAM-TCC-TTT-GCA-
CGC-CGT-GGG-AC-TAMRA-3’

B. Alat Pengujian

PCR Cabinet (Esco), Sentrifuge (Hermle Z 233 MK-2), Vortex (Maxi Mix II
Barnstead Thermolyne), Spindown (Hermle Z 100 M), Thermocycler (ABI 7500,

Applied Biosystems).

C. Pembuatan Pembuatan PCR Reaction Mix, Penambahan Template dan
Amplifikasi DNA

1. Pengerjaan pembuatan PCR Reaction Mix dilakukan di PCR Cabinet.
2. Tabung PCR disiapkan sejumlah sampel yang akan diuji ditambah dengan
kontrol positif dan kontrol negatif.

3. Dalam pembuatan PCR Reaction Mix harus dalam keadaan dingin.
4. Tabung untuk PCR Reaction Mix disiapkan dan masukkan reagen 2X RT-
PCR Buffer sebanyak 12,5 µl dikalikan jumlah reaksi yang dikehendaki.

5. Tambahkan reagen H2O sebanyak 1,5 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.

6. Tambahkan primer Forward 20 µM sebanyak 2 µl dikalikan jumlah reaksi
yang dikehendaki.
7. Tambahkan primer Reverse 20 µM sebanyak 2 µl dikalikan jumlah reaksi

yang dikehendaki.
8. Tambahkan probe 10 µM sebanyak 1,5 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.

9. Tambahkan reagen 25X RT-PCR Enzyme Mix sebanyak 0.5 µl dikalikan
jumlah reaksi yang dikehendaki.
10. PCR Reaction Mix sebanyak 20 µl dibagi ke sejumlah tabung PCR yang

sudah disiapkan.
11. Tambahkan RNA template (sampel uji / kontrol positif / kontrol negatif)

sebanyak 5 µl ke dalam tabung PCR yang sudah berisi PCR Reaction Mix
20 µl sehingga jumlah total menjadi 25 µl.

22