Page 14 - SOP Uji Biomolekuler untuk PMK
P. 14
5.2.5 Purifikasi Produk PCR
1. Gunakan scalpel bersih untuk memotong fragmen DNA dari gel agarose. Timbang berat
potongan gel dan masukkan dalam tube bersih. Tambahkan 200 µL Buffer NTI untuk tiap
100 mg gel agarose dengan konsentrasi kurang dari 2%. Inkubasikan selama 5-10 menit
pada suhu 50°C dan lakukan vortex setiap 2-3 menit hingga potongan gel larut sempurna.
2. Pindahkan sampel ke NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Column. Lakukan sentrifus 11,000
g selama 30 detik.
3. Buang cairan pada tampungan dan tambahkan 700 µL Buffer NT3 pada NucleoSpin Gel
and PCR Clean-up Column. Lakukan sentrifus 11,000 g selama 30 detik.
4. Sentrifus kembali pada 11,000 g selama 1 menit untuk menghilangkan Buffer NT3 secara
sempurna.
5. Pindahkan NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Column pada tube 1,5 mL yang baru.
Tambahkan 22,5 µL Buffer NE dan inkubasikan pada suhu ruang selama 1 menit. Lakukan
sentrifus 11,000 g selama 1 menit.
5.2.6 Cycle Sequencing
1. Pengerjaan pembuatan Mix dilakukan di PCR Cabinet.
2. Tabung PCR disiapkan sejumlah sampel yang akan diuji.
3. Dalam pembuatan Mix harus dalam keadaan dingin.
4. Tabung untuk Mix disiapkan dan masukkan reagen BigDye™ Terminator 3.1 Ready
Reaction Mix sebanyak 10 µl dikalikan jumlah reaksi yang dikehendaki.
5. Tambahkan reagen BigDye ™ Terminator v1.1 & v3.1 5X Sequencing Buffer sebanyak 2
µl dikalikan jumlah reaksi yang dikehendaki.
6. Tambahkan reagen nuclease-free water sebanyak 2 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.
7. Tambahkan primer Forward atau primer Reverse 3,2 µM sebanyak 1 µl dikalikan jumlah
reaksi yang dikehendaki.
8. Mix sebanyak 15 µl dibagi ke sejumlah tabung PCR yang sudah disiapkan.
9. Tambahkan DNA template sebanyak 5 µl ke dalam tabung PCR yang sudah berisi Mix 15
µl sehingga jumlah total menjadi 20 µl.
10. Vortex agar tercampur homogen.
11. Dilakukan spin down.
12. Masukkan ke dalam mesin thermal cycler dengan program sebagai berikut :
SOP UJI BIOMOLEKULER PMK Pusvetma 2020 Rev 2024 | 14
