Page 6 - SOP Uji Biomolekuler untuk PMK

3. UJI REAL-TIME PCR PMK (3D dan 5’UTR)

3.1. Alat dan Bahan
Bahan
1. QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)

2. AgPath-ID One Step RT-PCR Kit (Ambion)

3. 3D forward primer: 5’- ACT-GGG-TTT-TAC-AAA-CCT-GTG-A -3’
3D reverse primer: 5’-GCG-AGT-CCT-GCC-ACG-GA -3’
3D probe: 5’-FAM-TCC-TTT-GCA-CGC-CGT-GGG-AC-TAMRA-3’

4. 5’UTR forward primer: 5’-CACYT-YAAGR-TGACA-YTGRT-ACTGG-TAC-3’
5’UTR reverse primer: 5’-CAGAT-YCCRA-GTGWC-ICITG-TTA-3’

5’UTR probe: 5’-FAM-CCTCG GGGTA-CCTGA-AGGGC-ATCC-TAMRA-3’
Alat

BioSafety Cabinet, PCR Cabinet, Mikropipet, Sentrifus, Vortex, Spindown, Thermal cycler
(QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System, Applied Biosystems).

3.2. Prosedur Uji
3.2.1 Ekstraksi RNA

1. Buffer AVL sebanyak 560 μl yang mengandung carrier RNA dengan perbandingan :
volume Buffer AVL 0,56 ml + carrier RNA-AVE 5,6 μl dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml.

2. Tambahkan sampel sebanyak 140 μl, vortex 15 detik.
3. Inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.

4. Spin down sebentar.
5. Kemudian ditambahkan 560 μl Ethanol absolut, divortex 15 detik, lalu dilakukan spin

down.
6. Ambil 630 μl cairan dari step 5 lalu dimasukkan ke dalam spin column dan disentrifus

dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Letakkan spin column pada tabung
penampung yang bersih, dan buang tabung penampung yang mengandung filtrat.

7. Ulangi step 6.
8. Tambahkan 500 μl Buffer AW1 kemudian disentrifus dengan kecepatan 8.000 rpm selama

1 menit. Letakkan spin column pada tabung penampung yang bersih, dan buang tabung
penampung yang mengandung filtrat.

9. Tambahkan 500 μl Buffer AW2 kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm
selama 3 menit.

SOP UJI BIOMOLEKULER PMK Pusvetma 2020 Rev 2024 | 6