Page 7 - SOP Uji Biomolekuler untuk PMK
P. 7
10. Rekomendasi: Letakkan spin column pada tabung penampung yang bersih, dan buang
tabung penampung yang mengandung filtrat. Sentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm
selama 1 menit.
11. Letakkan spin column ke tube 1,5 ml dan buang tabung penampung yang mengandung
filtrat.
12. Tambahkan 60 μl Buffer AVE dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit lalu
disentrifus dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit.
3.2.2 Pembuatan PCR Reaction Mix, Penambahan Template dan Amplifikasi DNA
1. Pengerjaan pembuatan PCR Reaction Mix dilakukan di PCR Cabinet.
2. Tabung PCR disiapkan sejumlah sampel yang akan diuji ditambah dengan kontrol positif
dan kontrol negatif.
3. Dalam pembuatan PCR Reaction Mix harus dalam keadaan dingin.
4. Tabung untuk PCR Reaction Mix disiapkan dan masukkan reagen 2X RT-PCR Buffer
sebanyak 12,5 µl dikalikan jumlah reaksi yang dikehendaki.
5. Tambahkan reagen nuclease-free water sebanyak 1 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.
6. Tambahkan primer Forward 10 µM sebanyak 2 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.
7. Tambahkan primer Reverse 10 µM sebanyak 2 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.
8. Tambahkan probe 10 µM sebanyak 1,5 µl dikalikan jumlah reaksi yang dikehendaki.
9. Tambahkan reagen 25X RT-PCR Enzyme Mix sebanyak 1 µl dikalikan jumlah reaksi yang
dikehendaki.
10. PCR Reaction Mix sebanyak 20 µl dibagi ke sejumlah tabung PCR yang sudah disiapkan.
11. Tambahkan RNA template (sampel uji / kontrol positif / kontrol negatif) sebanyak 5 µl ke
dalam tabung PCR yang sudah berisi PCR Reaction Mix 20 µl sehingga jumlah total
menjadi 25 µl.
12. Vortex agar tercampur homogen.
13. Dilakukan spin down.
14. Masukkan ke dalam mesin thermal cycler dengan program sebagai berikut :
1x suhu 50ºC selama 2 menit
1x suhu 95ºC selama 10 menit
50x suhu 95ºC selama 15 detik, suhu 60ºC selama 1 menit
SOP UJI BIOMOLEKULER PMK Pusvetma 2020 Rev 2024 | 7
